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Universidade do Minho
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Breve resumo:
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Título: Development of a scalable bioprocess for large-scale production of a recombinant protein for the cosmetic industry
Autor: Costa, Aurora Gabriela Fernandes Ferreira
Resumo: Os avanços biotecnológicos têm aberto novas possibilidades para a produção sustentável de
compostos bioativos, como proteínas e péptidos, com aplicações em formulações cosméticas. A levedura
Pichia pastoris tem-se destacado como um sistema de expressão robusto e eficiente, especialmente
quando controlado pelo promotor AOX1, que é induzido por metanol. No entanto, a otimização de
estirpes, condições de fermentação e estratégias de purificação é fundamental para maximizar os
rendimentos de proteínas recombinantes. Este estudo focou-se no desenvolvimento de um bioprocesso
para a produção de uma proteína recombinante em P. pastoris, utilizando quatro variantes com diferentes
sequências do fator-α de acasalamento: αMF (fator-α completo), ΔαMF (fator-α truncado com deleção
em Δ57–70), Ost1-αMF (região pré do fator-α substituída pelo sinal Ost1 de Saccharomyces cerevisiae)
e Epx1-αMF (região pré substituída pelo sinal Epx1 de P. pastoris). Estas variantes foram projetadas para
explorar diferentes eficácias de secreção e estabilidade da proteína de interesse durante a produção.
Os rastreios iniciais em meio BMMY permitiram identificar a variante ΔαMF como a mais
promissora na produção da proteína recombinante, apresentando maiores níveis de expressão.
Posteriormente, a otimização em frascos de cultura demonstrou que a redução da temperatura de
indução de 28 para 22 °C aumentou significativamente a expressão da proteína na variante ΔαMF3.
Para a purificação, recorreu-se a esferas magnéticas de níquel, visando aproveitar a cauda de poli histidina presente na proteína para um processo de purificação baseado na afinidade. No entanto, esta
abordagem não atingiu o nível de pureza desejado, provavelmente devido à baixa acessibilidade da
cauda. Tentou-se também o uso do Ciclo de Transição Inversa (ITC), mas esta abordagem foi ineficaz
para purificação, devido à elevada temperatura de transição necessária para a proteína, que possui uma
superfície altamente carregada. Uma purificação parcial da proteína foi finalmente alcançada através da
acidificação dos sobrenadantes. Apesar disso, novos passos de purificação serão necessários para atingir
a pureza completa da proteína, essencial para a aplicação cosmética. Na ampliação do processo, foram
realizados ensaios de fermentação em biorreatores com diferentes concentrações de glicerol. Observou se que a concentração de 4 % (v/v) de glicerol resultou num crescimento celular superior e um
rendimento proteico mais elevado em comparação com 1 % (v/v). Estes resultados demonstraram o
potencial do processo desenvolvido para a produção em larga escala de proteínas recombinantes para
aplicações inovadoras na indústria cosmética.; Biotechnological advancements have opened new avenues for the sustainable production of
bioactive compounds, such as proteins and peptides, with potential applications in cosmetic formulations.
The yeast Pichia pastoris is widely recognized as a robust expression system, particularly under the
control of the methanol-inducible AOX1 promoter. However, optimizing strain selection, fermentation
conditions, and purification strategies is critical for maximizing recombinant protein yields. This study
focuses on developing a scalable bioprocess for producing a recombinant protein in P. pastoris, using
four variants, each carrying a different α-factor sequence: αMF (full-length α-factor), ΔαMF (truncated α factor with Δ57–70 deletion), Ost1-αMF (α-factor pre-region replaced by Saccharomyces cerevisiae Ost1
signal), and Epx1-αMF (α-factor pre-region replaced by P. pastoris Epx1 signal). These variants were
designed to explore different secretion efficiencies and stability during production.
Initial experiments in the BMMY medium identified ΔαMF as the most promising variant for target
protein production, showing higher expression levels. Further optimization in shake-flask cultures revealed
that reducing the induction temperature from 28 to 22 °C significantly enhanced expression levels of the
ΔαMF variant. For purification, nickel magnetic beads were used to take advantage of the polyhistidine
tag on the recombinant protein for an affinity-based purification process. However, this approach did not
achieve the desired protein purity, likely due to the low accessibility of the tag. Inverse Transition Cycling
(ITC) was also attempted, but this approach proved ineffective due to the high transition temperature
required for the protein, which has a highly charged surface. A partial purification of the protein was finally
achieved through acidification of the supernatants, allowing phase separation. Nevertheless, additional
purification steps will be necessary to attain complete protein purity, which is essential for cosmetic
applications. In scaling up the process, fermentation trials were conducted with different concentrations
of glycerol. It was observed that a glycerol concentration of 4 % (v/v) resulted in superior cell growth and
higher protein yield compared to 1 % (v/v). These findings demonstrated the potential of the developed
process for the large-scale production of recombinant proteins, for innovative applications in the cosmetic
industry.
Descrição: Dissertação de mestrado em Biotecnologia
<b>Tipo</b>: masterThesis
Autor: Costa, Aurora Gabriela Fernandes Ferreira
Resumo: Os avanços biotecnológicos têm aberto novas possibilidades para a produção sustentável de
compostos bioativos, como proteínas e péptidos, com aplicações em formulações cosméticas. A levedura
Pichia pastoris tem-se destacado como um sistema de expressão robusto e eficiente, especialmente
quando controlado pelo promotor AOX1, que é induzido por metanol. No entanto, a otimização de
estirpes, condições de fermentação e estratégias de purificação é fundamental para maximizar os
rendimentos de proteínas recombinantes. Este estudo focou-se no desenvolvimento de um bioprocesso
para a produção de uma proteína recombinante em P. pastoris, utilizando quatro variantes com diferentes
sequências do fator-α de acasalamento: αMF (fator-α completo), ΔαMF (fator-α truncado com deleção
em Δ57–70), Ost1-αMF (região pré do fator-α substituída pelo sinal Ost1 de Saccharomyces cerevisiae)
e Epx1-αMF (região pré substituída pelo sinal Epx1 de P. pastoris). Estas variantes foram projetadas para
explorar diferentes eficácias de secreção e estabilidade da proteína de interesse durante a produção.
Os rastreios iniciais em meio BMMY permitiram identificar a variante ΔαMF como a mais
promissora na produção da proteína recombinante, apresentando maiores níveis de expressão.
Posteriormente, a otimização em frascos de cultura demonstrou que a redução da temperatura de
indução de 28 para 22 °C aumentou significativamente a expressão da proteína na variante ΔαMF3.
Para a purificação, recorreu-se a esferas magnéticas de níquel, visando aproveitar a cauda de poli histidina presente na proteína para um processo de purificação baseado na afinidade. No entanto, esta
abordagem não atingiu o nível de pureza desejado, provavelmente devido à baixa acessibilidade da
cauda. Tentou-se também o uso do Ciclo de Transição Inversa (ITC), mas esta abordagem foi ineficaz
para purificação, devido à elevada temperatura de transição necessária para a proteína, que possui uma
superfície altamente carregada. Uma purificação parcial da proteína foi finalmente alcançada através da
acidificação dos sobrenadantes. Apesar disso, novos passos de purificação serão necessários para atingir
a pureza completa da proteína, essencial para a aplicação cosmética. Na ampliação do processo, foram
realizados ensaios de fermentação em biorreatores com diferentes concentrações de glicerol. Observou se que a concentração de 4 % (v/v) de glicerol resultou num crescimento celular superior e um
rendimento proteico mais elevado em comparação com 1 % (v/v). Estes resultados demonstraram o
potencial do processo desenvolvido para a produção em larga escala de proteínas recombinantes para
aplicações inovadoras na indústria cosmética.; Biotechnological advancements have opened new avenues for the sustainable production of
bioactive compounds, such as proteins and peptides, with potential applications in cosmetic formulations.
The yeast Pichia pastoris is widely recognized as a robust expression system, particularly under the
control of the methanol-inducible AOX1 promoter. However, optimizing strain selection, fermentation
conditions, and purification strategies is critical for maximizing recombinant protein yields. This study
focuses on developing a scalable bioprocess for producing a recombinant protein in P. pastoris, using
four variants, each carrying a different α-factor sequence: αMF (full-length α-factor), ΔαMF (truncated α factor with Δ57–70 deletion), Ost1-αMF (α-factor pre-region replaced by Saccharomyces cerevisiae Ost1
signal), and Epx1-αMF (α-factor pre-region replaced by P. pastoris Epx1 signal). These variants were
designed to explore different secretion efficiencies and stability during production.
Initial experiments in the BMMY medium identified ΔαMF as the most promising variant for target
protein production, showing higher expression levels. Further optimization in shake-flask cultures revealed
that reducing the induction temperature from 28 to 22 °C significantly enhanced expression levels of the
ΔαMF variant. For purification, nickel magnetic beads were used to take advantage of the polyhistidine
tag on the recombinant protein for an affinity-based purification process. However, this approach did not
achieve the desired protein purity, likely due to the low accessibility of the tag. Inverse Transition Cycling
(ITC) was also attempted, but this approach proved ineffective due to the high transition temperature
required for the protein, which has a highly charged surface. A partial purification of the protein was finally
achieved through acidification of the supernatants, allowing phase separation. Nevertheless, additional
purification steps will be necessary to attain complete protein purity, which is essential for cosmetic
applications. In scaling up the process, fermentation trials were conducted with different concentrations
of glycerol. It was observed that a glycerol concentration of 4 % (v/v) resulted in superior cell growth and
higher protein yield compared to 1 % (v/v). These findings demonstrated the potential of the developed
process for the large-scale production of recombinant proteins, for innovative applications in the cosmetic
industry.
Descrição: Dissertação de mestrado em Biotecnologia
<b>Tipo</b>: masterThesis
Info Adicional:
Título: Development of a scalable bioprocess for large-scale production of a recombinant protein for the cosmetic industry Autor: Costa, Aurora Gabriela Fernandes Ferreira Resumo: Os avanços biotecnológicos têm aberto novas possibilidades para a produção sustentável de compostos bioativos, como proteínas e péptidos, com aplicações em formulações cosméticas. A levedura Pichia pastoris tem-se destacado como um sistema de expressão robusto e eficiente, especialmente quando controlado pelo promotor AOX1, que é induzido por metanol. No entanto, a otimização de estirpes, condições de fermentação e estratégias de purificação é fundamental para maximizar os rendimentos de proteínas recombinantes. Este estudo focou-se no desenvolvimento de um bioprocesso para a produção de uma proteína recombinante em P. pastoris, utilizando quatro variantes com diferentes sequências do fator-α de acasalamento: αMF (fator-α completo), ΔαMF (fator-α truncado com deleção em Δ57–70), Ost1-αMF (região pré do fator-α substituída pelo sinal Ost1 de Saccharomyces cerevisiae) e Epx1-αMF (região pré substituída pelo sinal Epx1 de P. pastoris). Estas variantes foram projetadas para explorar diferentes eficácias de secreção e estabilidade da proteína de interesse durante a produção. Os rastreios iniciais em meio BMMY permitiram identificar a variante ΔαMF como a mais promissora na produção da proteína recombinante, apresentando maiores níveis de expressão. Posteriormente, a otimização em frascos de cultura demonstrou que a redução da temperatura de indução de 28 para 22 °C aumentou significativamente a expressão da proteína na variante ΔαMF3. Para a purificação, recorreu-se a esferas magnéticas de níquel, visando aproveitar a cauda de poli histidina presente na proteína para um processo de purificação baseado na afinidade. No entanto, esta abordagem não atingiu o nível de pureza desejado, provavelmente devido à baixa acessibilidade da cauda. Tentou-se também o uso do Ciclo de Transição Inversa (ITC), mas esta abordagem foi ineficaz para purificação, devido à elevada temperatura de transição necessária para a proteína, que possui uma superfície altamente carregada. Uma purificação parcial da proteína foi finalmente alcançada através da acidificação dos sobrenadantes. Apesar disso, novos passos de purificação serão necessários para atingir a pureza completa da proteína, essencial para a aplicação cosmética. Na ampliação do processo, foram realizados ensaios de fermentação em biorreatores com diferentes concentrações de glicerol. Observou se que a concentração de 4 % (v/v) de glicerol resultou num crescimento celular superior e um rendimento proteico mais elevado em comparação com 1 % (v/v). Estes resultados demonstraram o potencial do processo desenvolvido para a produção em larga escala de proteínas recombinantes para aplicações inovadoras na indústria cosmética.; Biotechnological advancements have opened new avenues for the sustainable production of bioactive compounds, such as proteins and peptides, with potential applications in cosmetic formulations. The yeast Pichia pastoris is widely recognized as a robust expression system, particularly under the control of the methanol-inducible AOX1 promoter. However, optimizing strain selection, fermentation conditions, and purification strategies is critical for maximizing recombinant protein yields. This study focuses on developing a scalable bioprocess for producing a recombinant protein in P. pastoris, using four variants, each carrying a different α-factor sequence: αMF (full-length α-factor), ΔαMF (truncated α factor with Δ57–70 deletion), Ost1-αMF (α-factor pre-region replaced by Saccharomyces cerevisiae Ost1 signal), and Epx1-αMF (α-factor pre-region replaced by P. pastoris Epx1 signal). These variants were designed to explore different secretion efficiencies and stability during production. Initial experiments in the BMMY medium identified ΔαMF as the most promising variant for target protein production, showing higher expression levels. Further optimization in shake-flask cultures revealed that reducing the induction temperature from 28 to 22 °C significantly enhanced expression levels of the ΔαMF variant. For purification, nickel magnetic beads were used to take advantage of the polyhistidine tag on the recombinant protein for an affinity-based purification process. However, this approach did not achieve the desired protein purity, likely due to the low accessibility of the tag. Inverse Transition Cycling (ITC) was also attempted, but this approach proved ineffective due to the high transition temperature required for the protein, which has a highly charged surface. A partial purification of the protein was finally achieved through acidification of the supernatants, allowing phase separation. Nevertheless, additional purification steps will be necessary to attain complete protein purity, which is essential for cosmetic applications. In scaling up the process, fermentation trials were conducted with different concentrations of glycerol. It was observed that a glycerol concentration of 4 % (v/v) resulted in superior cell growth and higher protein yield compared to 1 % (v/v). These findings demonstrated the potential of the developed process for the large-scale production of recombinant proteins, for innovative applications in the cosmetic industry. Descrição: Dissertação de mestrado em Biotecnologia Tipo: masterThesis
Autor:
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